La estructura del fitocromo A de Arabidopsis revela una diversificación topológica y funcional entre las isoformas fotorreceptoras de las plantas

Naturaleza Plantas (2023)Citar este artículo

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Las plantas emplean una cohorte divergente de fotorreceptores de fitocromos (Phy) para controlar muchos aspectos de la morfogénesis a través de la fotointerconversión reversible entre los confórmeros Pr inactivos y Pfr activos. Los dos más influyentes son PhyA, cuya retención de Pfr permite la sensación de poca luz, mientras que la relativa inestabilidad de Pfr para PhyB lo hace más adecuado para detectar pleno sol y temperatura. Para comprender mejor estos contrastes, resolvimos, mediante microscopía crioelectrónica, la estructura tridimensional de PhyA de longitud completa como Pr. Al igual que PhyB, PhyA se dimeriza a través del ensamblaje de cabeza a cabeza de sus dominios relacionados con la histidina quinasa C-terminal (HKRD), mientras que el resto se ensambla como una plataforma sensible a la luz de cabeza a cola. Mientras que la plataforma y los HKRD se asocian asimétricamente en los dímeros PhyB, estas conexiones asimétricas están ausentes en PhyA. El análisis del truncamiento y los mutantes dirigidos al sitio reveló que este desacoplamiento y el ensamblaje de la plataforma alterada tienen consecuencias funcionales para la estabilidad de Pfr de PhyA y destaca cómo la diversificación estructural de Phy de la planta ha ampliado la percepción de la luz y la temperatura.

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Los datos fuente para todos los gráficos de reversión térmica Pfr→Pr en las Figs. 5–7 se proporcionan en la Tabla complementaria 2. Las imágenes de los geles SDS-PAGE completos se proporcionan en la Figura complementaria 3. El mapa de consenso crio-EM 3D del dímero PhyA de Arabidopsis de longitud completa con una resolución de 3,2 Å se ha depositado en la EMDB base de datos con el código de acceso EMD-28870. La plataforma de enfoque refinado y los mapas HKRD con una resolución promedio de 3,1 Å y 3,4 Å, respectivamente, se han depositado en la base de datos EMDB con los códigos de acceso EMD-28871 y EMD-28872. El mapa 3D compuesto se ha depositado en la base de datos EMDB con el código de acceso EMD-28869, y su modelo atómico correspondiente está disponible en la base de datos RCSB con el código PDB 8F5Z. Este estudio hizo uso de varias estructuras de proteínas disponibles públicamente para Phys y las histidina quinasas transmisoras que se obtuvieron de la base de datos RCSB (http://www.rcsb.org) con los códigos de acceso 2VEA, 6TC5, 6TC7, 6TL4, 4U7O y 7RZW. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Los datos de crio-EM se recopilaron en un microscopio Titan Krios en la suite de microscopía crio-electrónica David Van Andel en el Instituto Van Andel. Agradecemos a G. Zhao y X. Meng por su ayuda con la recopilación de datos de EM, H. Zaher por su ayuda con los ensayos de quinasa y C. Sherman por su asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por las subvenciones R01 de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. GM127892 y GM127892-05 (a RDV) y GM131754 (a Huilin Li), y por fondos proporcionados por la Universidad de Washington en St. Louis (a RDV) y el Instituto Van Andel. (a Huilin Li).

Katrice E. McLoughlin

Dirección actual: Burning Rock Dx, Irvine, CA, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: E. Sethe Burgie, Hua Li, Zachary TK Gannam.

Departamento de Biología, Universidad de Washington en St. Louis, St. Louis, MO, EE. UU.

E. Sethe Burgie, Zachary TK Gannam, Katrice E. McLoughlin y Richard D. Vierstra

Departamento de Biología Estructural, Instituto Van Andel, Grand Rapids, MI, EE. UU.

Hua Li y Huilin Li

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ESB, Hua Li, ZTKG, RDV y Huilin Li diseñaron los experimentos. Hua Li realizó la reconstrucción crio-EM y 3D. ESB y Hua Li construyeron y refinaron los modelos atómicos. ESB, ZTKG y KEM expresaron y purificaron las muestras de Phy ensambladas y realizaron los ensayos espectroscópicos y de mutagénesis. ESB, Hua Li, ZTKG, Huilin Li y RDV escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Richard D. Vierstra o Huilin Li.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a Andreas Möglich, Xiaojing Yang y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, análisis SDS-PAGE de la PhyA recombinante de longitud completa. Los geles se tiñeron para proteínas con azul de Coomassie (izquierda) o se analizaron para PΦB unido mediante fluorescencia inducida por zinc (derecha). MM, estándares de masa molecular. Las muestras eran indistinguibles de las descritas por Burgie et al.6 b, espectros de absorbancia UV-vis de PhyA. Los espectros se recolectaron de muestras adaptadas a la oscuridad (Pr) o después de saturar la irradiación con luz roja de 630 nm (RL, principalmente Pfr). Los máximos de absorción se determinaron a partir del espectro de diferencia mostrado al 70% de amplitud. La SCR a 664/723 nm se indica entre paréntesis. Los espectros fueron el promedio de tres repeticiones técnicas. c, Flujo de trabajo utilizado para el procesamiento de datos de las imágenes crio-EM de PhyA. En el primer mapa general refinado con una resolución de 3,5 Å basado en 421 969 partículas, casi todos los dominios PhyA se vieron bien excepto las regiones que abarcan los dominios PAS1, que se resolvieron de manera deficiente. Los refinamientos enfocados, excluyendo los dominios PAS1 y utilizando la sustracción de señal para las regiones PSM, PAS2 y HKRD, generaron un mapa de 3,2 Å con cierta ambigüedad en los HKRD. El uso posterior de máscaras separadas para los HKRD y la plataforma condujo a mapas EM mejorados de 3,1 Å y 3,4 Å para la plataforma y los HKRD, respectivamente, que se combinaron para generar el mapa compuesto final del dímero. 3DVA de imágenes de partículas muestreadas a 4,14 Å por píxel resolvió uno de los dominios PAS1 flexibles (púrpura) con una resolución de ~15 Å. d, se muestra una micrografía crio-EM representativa después de la corrección de movimiento. En total, se utilizaron datos de 6195 micrografías independientes para la construcción del mapa. e, Promedios de clase 2D seleccionados que muestran múltiples vistas de las partículas.

a, El mapa de consenso 3D EM y la plataforma individual refinada de enfoque y los mapas HKRD codificados por colores según la resolución local. b, Distribución del ángulo euleriano de imágenes de partículas sin procesar utilizadas en la reconstrucción 3D final. c, correlación de capa de Fourier estándar de oro (FSC) de dos medios mapas (curva naranja) y la correlación del modelo atómico y el mapa 3D compuesto final (curva púrpura).

El mapa se muestra en malla gris, mientras que los modelos 3D de los motivos/residuos se muestran en dibujos animados/palos y coloreados como en la Fig. 1e. Los paneles ac incluyen PΦB (barras rojas) para resaltar la proximidad al cromóforo. Se indican los residuos clave. a, Lazo de nudo que se extiende desde el dominio GAF para rodear la extensión N-terminal (NTE) justo aguas arriba del dominio nPAS. b, Residuos 69–81 que comprenden parte del NTE cerca del lazo de nudo que llega cerca del cromóforo. c, Vistas ortogonales de la horquilla que se extiende desde el dominio PHY para contactar el dominio GAF cerca del cromóforo. d, El bucle modulador que se extiende entre los dominios PAS1 y PAS2 para interactuar con el dominio PHY de su propio protómero. e, Los dominios DHp emparejados dentro del HKRD. Se indican las hélices α1 y α2. La característica cruzada dentro de la hélice α1 está ubicada entre corchetes. El residuo 905 (R905), que normalmente está ocupado por una histidina en las histidina quinasas transmisoras, está resaltado por el óvalo rojo. f, vistas de primer plano de las conexiones entre el dominio PAS2 del protómero B y los dominios nPAS y GAF del protómero A dentro del dímero. g, predicción estructural del pliegue PAS1 por TrRosetta (izquierda) y congruencia de esta predicción (gris) con los modelos crio-EM de los dominios PAS2 (centro) y nPAS de PhyA (derecha) que se muestran en color. Se indican los extremos N- y C-terminal. Para los paneles (e) y (f), el esqueleto peptídico se muestra en dibujos animados, mientras que las cadenas laterales de aminoácidos están en barras. Las designaciones principales identifican residuos del protómero B.

Las complejas interconectividades de los dominios dentro del PSM se muestran en las tres vistas superiores. Las vistas cuarta y quinta resaltan la conexión del bucle modulador (Mod)/dominio PHY, que proporciona un enlace estructural intraprotómero con el PSM, y su conectividad con las características de la horquilla, la columna helicoidal y el dominio PAS2. La sexta vista muestra la mitad de la interfaz dimérica del HKRD que involucra las hélices α de los dominios DHp y CA. Se indican los residuos clave; las designaciones principales indican las del protómero B.

a, Diagramas de los contactos. Se muestran las regiones que interactúan en el contexto de sus configuraciones de hélice α, hebra β o bucle. Los diagramas de la izquierda resaltan las interacciones del interprotómero HKRD entre los dominios DHp y CA. Los diagramas de la derecha resaltan las interacciones entre los dominios HKRD (cian/verde azulado) y GAF (verde) y PHY (naranja) dentro de la plataforma. Las líneas ubican los residuos específicos involucrados en los contactos previstos; se muestran las conexiones que se encuentran dentro de PhyA, PhyB o ambas. (A) y (B) se refieren a los protómeros A y B dentro del dímero, respectivamente. La numeración de aminoácidos corresponde a la que se encuentra dentro de PhyA o PhyB. Algunas hebras o hélices se incluyen para el contexto estructural pero no se encuentra que participen en las interacciones. b, Alineación de secuencias de las regiones dentro de AtPhyA y AtPhyB que participan en los contactos que se muestran en (a). Los aminoácidos idénticos y similares están coloreados en cuadros negros y grises, respectivamente. Las barras de arriba delimitan las características de hélice α (roja) y hebra β (azul). Los círculos verdes a continuación identifican aminoácidos específicos que participan en los contactos que se muestran en (a).

a, Organización del dominio de truncamientos PhyA y NTE de longitud completa (FL) que comienzan en el residuo 25 (NΔ24) y 66 (NΔ65). La duración de la NTE se amplió para mayor claridad. Las líneas rojas discontinuas representan la interacción de PΦB con los residuos de NTE Tyr-70 e Ile-74. b, Tasas de reversión térmica de FL PhyA y su PSM con los truncamientos NTE NΔ24 y NΔ65. Se muestran los puntos de datos y las líneas de ajuste representativas de tres réplicas técnicas (consulte la Tabla 2 de datos ampliados para los análisis estadísticos). También se incluyen datos de reversión térmica de Pfr→Pr para fragmentos de PSM de Arabidopsis PhyA con truncamientos de NTE comparables, medidos nuevamente aquí para completarlos; consulte también Burgie et al.6. Debido a que las velocidades de reacción difieren en órdenes de magnitud, se muestran velocidades en dos escalas de tiempo: panel izquierdo, 120 min; panel derecho, 1200 min. Los geles SDS-PAGE y los espectros de absorción y diferencia Pr-Pfr para las preparaciones se muestran en las Figs. 1 y 2

a, vistas ortogonales de la región CA de HKRD de At PhyA superpuestas con la misma región de At PhyB (código de ID de PDB 7RZW22) y el transmisor procariota Walk HK de Lactobacillis plantarum (Lp) (código de ID de PDB 4U7O32). b y c, modelos que muestran la posición predicha de ADP (rojo) en el dominio At PhyA CA en función del bolsillo de unión descrito en Lp WalK32. Los residuos que se espera que participen en la unión se indican en (b). ADP choca con múltiples residuos en el bolsillo de este modelo PhyA-ATP predicho, lo que indica que los cambios conformacionales en At PhyA inducidos por ATP o fotoactivación serían necesarios para la unión. Los sitios con conflicto sustancial están encerrados en un círculo. d, alineación de la secuencia de aminoácidos del posible bolsillo de unión a ATP de At PhyA y At PhyB con dominios CA comparables de histidina quinasas de buena fe de Bacillus subtilis (Bs YFI), Thermotoga maritima (Tm HK853), L. plantarum (Lp Walk) y Streptococcus mutans (Sm Vick), y con los de bacterias Phys (BphPs) con actividades HK/fosfatasa de Pseudomonas syringae (Ps BphP)18 y Deinococcus radiodurans (Dr BphP)16. Los aminoácidos idénticos y similares están coloreados en cuadros negros y grises, respectivamente. Se indican las casillas N, G1/D, F y G2 de la firma y la tapa ATP para las histidina quinasas32. Las puntas de flecha ubican residuos clave dentro del bolsillo de unión de ATP que son críticos para la catálisis32. por ejemplo, At PhyA es una quinasa pobre en comparación con Ps BphP en base a ensayos de autofosforilación. Se incubaron cantidades equimolares de biliproteínas recombinantes durante 1 min a 2 h a temperatura ambiente (~24 °C) con 150 μM de ATP suplementado con 10 μCi de [γ-32P]-ATP, se extinguieron con tampón de muestra SDS-PAGE y se midieron para Incorporación de 32P por autorradiografía de geles SDS-PAGE. e, Evolución temporal de la autofosforilación de Ps BphP como Pfr. f, Comparaciones de las actividades de autofosforilación de At PhyB como Pr y Pfr con las de Ps BphP después de 2 horas de incubación. Las puntas de flecha localizan Ps BphP. Los escaneos de phosphorimager son representativos de tres experimentos independientes. g, Imágenes de los geles SDS-PAGE teñidos para proteínas con azul de Coomassie o para la bilina unida por fluorescencia inducida por zinc.

La Tabla complementaria 1 y las Figs. 1–3.

Película del dímero PhyA de longitud completa resuelta a una resolución media de 3,2 Å. La película muestra primero un mapa EM giratorio seguido de una vista de dibujos animados giratorios del modelo resultante. Los dominios NTE, nPAS, GAF, PHY con horquilla, PAS2 con modulador y HKRD están en gris/negro, azul claro/oscuro, verde claro/oscuro, amarillo/naranja, rosa/magenta y cian claro/verde azulado, respectivamente. PΦB mostrado en barras rojas.

El HKRD de Arabidopsis PhyA no forma fuertes contactos no covalentes con la plataforma. 3DVA se utilizó para ayudar a describir el movimiento del HKRD con respecto a la plataforma en PhyA. Usando este procedimiento, se generaron 20 mapas EM promediando marcos de estructuras similares como se indica en el gráfico. Mostramos cuatro vistas ortogonales del mapa EM de PhyA para rastrear el movimiento de dominios. Se indican las posiciones de los dominios, incluidas las del dominio PAS1, que aparece próximo a los dominios PHY y PAS2 dentro de la plataforma. Los números de mapa se indican en la parte superior izquierda.

Datos de origen para cromatografía de exclusión por tamaño, espectros UV-vis y gráficos de cinética de reversión térmica en las Figs. 5–7.

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Reimpresiones y permisos

Burgie, ES, Li, H., Gannam, ZTK et al. La estructura del fitocromo A de Arabidopsis revela una diversificación topológica y funcional entre las isoformas de fotorreceptores de plantas. Nat. Plantas (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01435-8

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Recibido: 14 diciembre 2022

Aceptado: 10 de mayo de 2023

Publicado: 08 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01435-8

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