Imágenes de aterosclerosis con [64Cu]Cu

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9249 (2023) Citar este artículo

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La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica de las arterias más grandes que puede conducir a eventos cardiovasculares. La identificación de los pacientes con mayor riesgo de eventos cardiovasculares es un desafío, pero las imágenes moleculares mediante tomografía por emisión de positrones (PET) pueden resultar útiles. El objetivo de este estudio fue evaluar y comparar directamente tres trazadores PET diferentes. Además, la captación del marcador se compara con las alteraciones de la expresión génica de la pared del vaso arterial. Para el estudio se utilizaron conejos blancos machos de Nueva Zelanda (grupo de control; n = 10, grupo aterosclerótico; n = 11). La captación de la pared vascular se evaluó con los tres trazadores PET diferentes: [18F]FDG (inflamación), Na[18F]F (microcalcificación) y [64Cu]Cu-DOTA-TATE (macrófagos), utilizando PET/tomografía computarizada (TC) . La captación del trazador se midió como valor de captación estandarizado (SUV), y las arterias de ambos grupos se analizaron ex vivo mediante autorradiografía, qPCR, histología e inmunohistoquímica. En conejos, el grupo aterosclerótico mostró una captación significativamente mayor de los tres marcadores en comparación con el grupo control [18F]FDG: SUVmedia 1,50 ± 0,11 frente a 1,23 ± 0,09, p = 0,025; Na[18F]F: SUV medio 1,54 ± 0,06 frente a 1,18 ± 0,10, p = 0,006; y [64Cu]Cu-DOTA-TATE: SUV medio 2,30 ± 0,27 frente a 1,65 ± 0,16; p = 0,047. De los 102 genes analizados, 52 se expresaron de manera diferencial en el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo de control y varios genes se correlacionaron con la captación del marcador. En conclusión, demostramos el valor diagnóstico de [64Cu]Cu-DOTA-TATE y Na[18F]F para identificar aterosclerosis en conejos. Los dos trazadores PET proporcionaron información distinta a la obtenida con [18F]FDG. Ninguno de los tres marcadores se correlacionó significativamente entre sí, pero la absorción de [64Cu]Cu-DOTA-TATE y Na[18F]F se correlacionó con marcadores de inflamación. [64Cu]Cu-DOTA-TATE fue mayor en conejos ateroscleróticos en comparación con [18F]FDG y Na[18F]F.

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica de la pared de los vasos arteriales, caracterizada por la acumulación de lípidos y elementos fibrosos1. Como una de las principales causas de morbilidad y mortalidad cardiovascular, se justifican mejores tratamientos y herramientas de diagnóstico optimizadas.

Con el tiempo, la aterosclerosis puede progresar a placas vulnerables que en última instancia conducen a la ruptura de la placa2,3. La placa vulnerable se caracteriza por hemorragia intraplaca, infiltración de células inflamatorias, formación de neovasos de los vasa vasorum y desarrollo de una capa fibrosa delgada4. Durante la progresión de la aterosclerosis, se produce la calcificación. Los procesos inflamatorios involucrados en la progresión de la aterosclerosis son objetivos esenciales para visualizar y tratar la aterosclerosis.

Para la caracterización funcional y el seguimiento del tratamiento, las modalidades de imágenes moleculares no invasivas son muy útiles. Las imágenes moleculares se especializan en visualizar componentes celulares específicos o vías metabólicas. La tomografía por emisión de positrones (PET) proporciona información valiosa sobre diferentes procesos moleculares5. El trazador PET más utilizado en un entorno clínico es la 2-[18F]fluoro-2-desoxi-D-glucosa ([18F]FDG)6. Se acumula en células metabólicamente activas, como los macrófagos vasculares que se encuentran en la placa inflamada. [18F]FDG es útil para cuantificar y rastrear la inflamación en la aterosclerosis7,8,9,10,11. Desafortunadamente, la captación fisiológica de [18F]FDG por parte de los cardiomiocitos desafía la visualización de la inflamación en las arterias coronarias12. Estas limitaciones pueden eliminarse utilizando otros trazadores PET con menor captación miocárdica. El marcador PET [64Cu]Cu-DOTA-TATE detecta la expresión del receptor de somatostatina 2 (SSTR2) en la superficie de los macrófagos activados. Por lo tanto, se ha demostrado útil para evaluar la inflamación vascular13,14,15. Otro trazador de PET, Na[18F]F, se ha utilizado para la caracterización de microcalcificaciones tempranas de la pared de los vasos vasculares16,17,18. Se sugiere que la captación de Na[18F]F puede servir como un biomarcador no invasivo en la estratificación del riesgo de pacientes cardiovasculares aumentados19. Los tres trazadores de PET se han investigado por separado. Sin embargo, hasta donde sabemos, no se ha llevado a cabo una comparación directa de los marcadores y la correlación con las alteraciones de la expresión génica subyacentes en la pared del vaso.

En este estudio, nuestro objetivo fue evaluar y caracterizar los componentes moleculares clave del proceso aterosclerótico en un modelo de conejo. Se utilizaron tres trazadores de PET dirigidos a la inflamación y la microcalcificación y se compararon las captaciones de PET con las alteraciones de la expresión génica en la pared de los vasos arteriales.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las aprobaciones correspondientes del Comité de Investigación Animal del Ministerio de Justicia danés (número de licencia: 2016-15-0201-00831) y el estudio se realizó siguiendo las pautas ARRIVE y AVMA. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes.

Veintiún conejos SPF New Zealand White machos (11 semanas de edad) se aleatorizaron en un grupo de control (n = 10) y un grupo aterosclerótico (n = 11) (KB Lidköping Kaninfarm, Suecia). Los conejos estaban alojados individualmente. La aterosclerosis fue inducida por una combinación de dieta y denudación de la aorta abdominal y torácica. El grupo aterosclerótico recibió una dieta alta en colesterol (HCD) que contenía 0,30% de colesterol, dos semanas antes de la primera cirugía. Después de ocho semanas y del período de estudio de recuperación, los conejos se cambiaron a HCD al 0,15%. El grupo de control fue alimentado con una dieta de comida normal (ver esquema de estudio Fig. 1).

Características generales del grupo control y del grupo aterosclerótico. Resumen del estudio con intervenciones dietéticas (Dieta alta en colesterol que contiene 0,30 % de colesterol y 0,15 % de colesterol) e intervenciones quirúrgicas para el grupo aterosclerótico junto con tiempos de exploración para ambos grupos. T0 = inicio del estudio, dos semanas después (T2) se realizó la primera intervención quirúrgica y cinco semanas después del inicio (T5) se realizó la segunda intervención quirúrgica. Después de ocho semanas (T8), la dieta se cambió de 0,30 % HCD a 0,15 % HCD. El estudio continuó durante otras 16 semanas y después de 20 semanas (T20) se finalizó el estudio mediante exploraciones PET/CT de los conejos seguidas de análisis ex vivo.

En condiciones asépticas, el grupo aterosclerótico fue denudado localizando primero la arteria femoral en una de las extremidades. Luego se introduce un catéter de embolectomía 4F-Fogarty en la arteria antes de avanzar el balón aproximadamente 20 cm. Se realizó una acción repetitiva inflando el balón y retrayéndolo tres veces para asegurar la lesión vascular. Finalmente, las capas musculares y la piel se cerraron con suturas absorbibles y no absorbibles, respectivamente. El procedimiento se repitió después de tres semanas en la extremidad contralateral. Profilaxis de infecciones: se inyectó enrofloxacina (15 mg/kg) por vía intramuscular antes de la cirugía.

El postoperatorio consistió en el analgésico buprenorfina (0,01-0,05 mg/kg, inyección subcutánea (sc)) en combinación con ketoprofeno (3 mg/kg, inyección intramuscular (im)), administrado el día de la cirugía.

La eutanasia de los conejos consistió en una sedación inicial mediante una inyección de ketamina (35 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) im seguida de una inyección letal de penobarbital (140 mg/kg) iv siguiendo las pautas de la AVMA para la eutanasia de animales

Todos los conejos (n = 21) se escanearon en línea base en un sistema de tomografía computarizada (TC)/PET dedicado para animales pequeños (Inveon, Siemens Medical Systems, PA, EE. UU.) con el marcador [18F]FDG después de lo cual los conejos se aleatorizaron en dos grupos. Las exploraciones se realizaron como una exploración de posición en una cama que cubría la aorta abdominal. Las exploraciones se realizaron 3 semanas antes de la cirugía del grupo aterosclerótico y veinte semanas después de la cirugía, se realizaron exploraciones terminales en ambos grupos con diferentes marcadores: (1) [18F]FDG, (2) Na[18F]F y ( 3) [64Cu]Cu-DOTA-TATE. Los tres trazadores circularon durante 60 min antes de la imagen PET con un tiempo de adquisición de 1200 s. La dosis radiactiva para cada trazador fue: 123,4 ± 15,6 MBq ([18F]FDG), 116,0 ± 10,2 MBq (Na[18F]F) y 84,41 ± 5,78 MBq ([64Cu]Cu-DOTA-TATE). Los 3 escaneos se realizaron en un orden aleatorio para asegurar la autorradiografía ex vivo de los 3 marcadores para ambos grupos. Para permitir la descomposición física de los trazadores, un intervalo de al menos 24 h después de la inyección del trazador con compuestos marcados con 18F (vida media física de 18F: 110 min) y 72 h después de la inyección de [64Cu]Cu-DOTA-TATE (vida media física de 18F: 110 min) -vida útil del 64Cu: 12,7 h) asegurada.

Las imágenes se analizaron como imágenes PET/CT fusionadas utilizando el software Inveon Research Workspace 4.2 (Siemens Medical Systems, PA, EE. UU.) dibujando regiones de interés (ROI) circulares en la aorta abdominal, desde la bifurcación ilíaca hasta la arteria renal derecha en cada tercera diapositiva. Las regiones de interés se dibujaron en el plano axial de las imágenes de TC y se superpusieron a las imágenes de PET alineadas. Se creó un cilindro de volumen a partir de todos los ROI dibujados en la aorta, volumen de interés (VOI). Los valores medios de captación estandarizados (SUVmedia) se calcularon como la captación del trazador en el VOI dividida por la actividad inyectada corregida por deterioro y dividida por el peso del conejo. Los resultados se informan como el SUV promedio para todo el segmento aórtico (SUVmean) para una mejor comparación con los resultados de expresión génica. Las relaciones de trazador a fondo (TBR) se obtuvieron como la captación de [18F]FDG en la arteria dividida por la captación de [18F]FDG de la sangre en la vena.

Inmediatamente después de la última exploración, se sacrificó a los conejos y se seleccionaron segmentos de la aorta para un análisis ex vivo específico. Se realizó autorradiografía para los tres trazadores con el arco aórtico y la mitad de la aorta torácica descendente (n = 4 para cada trazador). Se eligió la parte torácica de la aorta para la autorradiografía porque el tejido se comprimía durante la exposición en el casete y queríamos preservar la morfología en la parte abdominal donde se realizó la imagen PET/CT.

Se eligió una parte inferior de la aorta abdominal por encima de la bifurcación ilíaca para la extracción de ARN.

La parte torácica, el resto de la aorta abdominal y el arco aórtico se fijaron en formalina al 4% durante 24 h antes de ser seccionados en piezas de 2-3 mm e incluidos en parafina. Se obtuvieron una serie de cortes axiales (4 µm de espesor) y se seleccionaron para histología e inmunohistoquímica (IHC).

Para la caracterización morfológica general se realizó tinción de Hematoxilina y Eosina (H&E) y tinción de Von Kossa para calcificaciones.

Para IHC, se utilizó RAM 11 (Monoclonal Mouse Anti-Rabbit Macrophage, Clone RAM11, Agilent DAKO, EE. UU.) para evaluar la infiltración de macrófagos. Se usó Envision FLEX DAB + Substrate Chromogen System (Agilent, DAKO, EE. UU.) para exponer la inmunorreactividad junto con hematoxilina como contratinción.

Inmediatamente después de la extracción, las aortas se almacenaron en solución de estabilización RNAlater (ThermoFisher, MA, EE. UU.) durante 24 h a 5 °C antes de retirarlas de la solución y almacenarlas a -80 °C hasta su uso posterior. Todos los reactivos y kits se adquirieron de QIAGEN (Hilden, Alemania). El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol® y se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit RT2 First Strand. Se utilizaron dos matrices diferentes: matriz de cicatrización de heridas de conejo (QIAGEN, matriz de PCR Profiler PANZ-121ZA-RT2) y una matriz personalizada (QIAGEN, CLAN32799A: matriz de PCR RT2 personalizada). Las placas se leyeron en el sistema de PCR en tiempo real Mx3000P (Stratagene, CA, EE. UU.). Los resultados se analizaron utilizando el software en línea GeneGlobe (QIAGEN). Los niveles de expresión génica de los genes de interés (GOI) se normalizaron al nivel de los genes de referencia ACTA2, ACTB, GAPDH, LDHA y el dominio no POU que contiene el tipo de unión a octámero (LOC100346936). Los datos se analizaron utilizando el método 2-deltaCt.

El análisis estadístico de los datos in vivo se obtuvo en GraphPad Prism versión 8 (GraphPad Software Inc., EE. UU.).

Se realizó una prueba t de dos colas no emparejadas para comparar la captación del marcador entre grupos en los diferentes puntos de tiempo y comparar la regulación de genes. La correlación entre los niveles de expresión génica y los trazadores se analizaron mediante la correlación de Pearson. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Todos los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM).

Las diferencias características entre los grupos ateroscleróticos y de control se evaluaron mediante análisis de imágenes moleculares, histología, IHC y expresión génica.

Al inicio del estudio, las exploraciones PET/TC con [18F]FDG no revelaron diferencias en la captación entre el grupo de control y el grupo aterosclerótico (SUVmedia 1,13 ± 0,07 frente a SUVmedia 1,04 ± 0,088; p = 0,9). Si bien la [18F]FDG aumentó significativamente desde el inicio hasta la finalización en el grupo aterosclerótico (p = 0,005), solo se observó un aumento pequeño y no significativo en el grupo de control de la misma edad durante el período de estudio de 20 semanas (p = 0,389)( figura 2D). Las características generales para el desarrollo aterosclerótico en las arterias fueron establecidas por histología (Fig. 2F).

[18F]FDG in vivo PET/CT Imaging y análisis ex vivo. (A) Imágenes de TC, PET y PET/TC fusionadas en el plano coronal, de un conejo control con captación de [18F]FDG. Los conejos de control muestran una captación homogénea de [18F]FDG (flecha roja que marca la arteria en las imágenes PET y PET/CT). (B) Imágenes de TC, PET y PET/TC fusionadas en el plano coronal de captación de [18F]FDG en un conejo aterosclerótico. La captación se visualiza claramente en toda la arteria abdominal en las imágenes PET y PET/CT marcadas con flechas rojas. Las barras de color están calibradas en SUV y sin fondo sustraído. Las barras de color son idénticas para los dos grupos. (C) Los diagramas de puntos muestran los valores medios de SUV in vivo ± SEM a partir de exploraciones iniciales y terminales de [18F]FDG. La exploración de referencia no muestra ninguna diferencia significativa (ns) entre los grupos. El grupo de control (n = 10) desde el inicio hasta la exploración terminal no mostró diferencias significativas, mientras que para el grupo aterosclerótico (n = 11) hubo una diferencia significativa en la captación de [18F]FDG (**), p = 0,0029. Las exploraciones terminales revelan una diferencia significativa (*) en la captación de [18F]FDG entre el grupo aterosclerótico y el grupo de control (SUVmedia 1,50 ± 0,112 frente a SUVmedia 1,23 ± 0,089, p = 0,025). (D) Diagramas de espagueti que muestran el cambio en la captación de [18F]FDG desde el inicio hasta el final del estudio para cada conejo de ambos grupos. (E) Las imágenes autorradiográficas muestran la unión de [18F]FDG en el arco aórtico y la arteria torácica descendente de un control y una arteria aterosclerótica. (F) Corte transversal de tinciones H&E de la arteria abdominal y el arco aórtico. La arteria aterosclerótica muestra engrosamiento de la pared y formación de placas que provocan una luz de la arteria estrechada en comparación con la luz de la arteria normal. El arco aórtico muestra cambios morfológicos similares a los de la arteria abdominal con aterosclerosis presente.

Al finalizar el estudio, la captación de [18F]FDG observada en las imágenes de TC, PET y PET/TC fusionadas fue evidentemente mayor en el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo de control (Fig. 2A,B). Observamos una captación significativamente mayor de [18F]FDG en el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo control (SUVmedia 1,50 ± 0,112 frente a 1,23 ± 0,089; p = 0,025; Fig. 2C,D). El grupo aterosclerótico tuvo una TBRmean de 1,11 ± 0,1 y una TBRmax de 2,20 ± 0,1, mientras que el grupo de control tuvo una TBRmean de 0,99 ± 0,1 y una TBRmax de 2,14 ± 0,1.

También se observó una mayor acumulación de [18F]FDG en el arco aórtico del grupo aterosclerótico mediante autorradiografía (fig. 2E). H&E encontró acumulación de células espumosas, cristales de colesterol y luces estrechas en las arterias ateroscleróticas. El grupo control mostró una pared arterial delgada e intacta (Fig. 2F).

Para la evaluación de las microcalcificaciones dentro de la pared del vaso arterial, se escanearon conejos con Na[18F]F PET/CT (Fig. 3A,B). Se observó una diferencia significativa en la captación entre el grupo aterosclerótico y el grupo control (SUVmedia 1,54 ± 0,057 frente a SUVmedia 1,18 ± 0,099; p = 0,006; fig. 3C). En el grupo aterosclerótico se observó una acumulación heterogénea y elevada de Na[18F]F mediante autorradiografía (fig. 3D), lo que confirma los hallazgos de la PET. La presencia y ubicación de microcalcificaciones dentro de las placas también se muestran mediante la tinción de Von Kossa (Fig. 3E).

[18F]NaF Imágenes PET/TC in vivo y análisis ex vivo. (A) Imágenes de TC, PET y PET/TC fusionadas en el plano coronal, de un conejo de control. Los conejos de control muestran una captación homogénea de [18F]NaF marcada con flechas rojas en PET y PET/CT. (B) Las imágenes de TC, PET y PET/TC fusionadas de un conejo aterosclerótico mostraron una mayor captación de [18F]NaF. [18F]NaF mostró una mayor captación específica en lesiones calcificadas de la arteria abdominal, lo que se puede ver en la TC, PET y PET/CT marcadas con una flecha roja en cada imagen. Las barras de color están calibradas en SUV sin restar fondo. Misma barra de escala utilizada en ambas imágenes. (C) Valores medios de SUV ± SEM de escaneos terminales [18F]NaF del grupo de control y el grupo aterosclerótico presentados por diagramas de puntos. El grupo aterosclerótico tuvo una captación significativamente mayor en comparación con el grupo control (SUVmedia 1,54 ± 0,057 frente a SUVmedia 1,18 ± 0,099, p = 0,006). (D) Las imágenes autorradiográficas con fósforo muestran la unión de [18F]NaF en el arco aórtico y la arteria torácica descendente de un control y una arteria aterosclerótica. (E) Sección transversal de la arteria abdominal teñida con Von Kossa. No se observaron depósitos de calcio, ya que ninguna de las arterias de control se tiñó positivamente para Von Kossa. La tinción de Von Kossa de la arteria abdominal aterosclerótica y el arco aórtico muestran depósitos de calcio (negro).

De acuerdo con los hallazgos de los otros 2 marcadores, encontramos que la captación de [64Cu]Cu-DOTA-TATE fue significativamente mayor para el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo control (SUVmedia 2,30 ± 0,266 frente a SUVmedia 1,65 ± 0,157; p = 0,047), lo que también se observó en las imágenes PET y PET/CT (fig. 4A-C). La acumulación de [64Cu]Cu-DOTA-TATE en las arterias del grupo aterosclerótico se confirmó mediante autorradiografía (Fig. 4D). La abundante infiltración de macrófagos dentro de las placas fue evidente a partir de la tinción con RAM11. Para las arterias de control no se observó presencia de macrófagos (Fig. 4E) lo que confirma la baja captación observada en PET y autorradiografía.

Imágenes de [64Cu]Cu-DOTA-TATE PET/CT y análisis ex vivo. (A) Imágenes de TC, PET y PET/TC fusionadas en el plano coronal, de un conejo control con captación de [64Cu]Cu-DOTA-TATE. La arteria está marcada con una flecha roja. B) Las imágenes de TC, PET y PET/TC fusionado de un conejo aterosclerótico con captación de [64Cu]Cu-DOTA-TATE mostraron una captación alta y homogénea en la arteria marcada con la flecha roja en ambas imágenes. Las barras de color se calibraron en SUV sin restar fondo. Misma barra de escala utilizada para ambas imágenes. (C) Los diagramas de puntos mostraron valores medios de SUV in vivo ± SEM de la exploración terminal de [64Cu]Cu-DOTA-TATE. El gráfico de puntos mostró una diferencia significativa (*) en la captación de [64Cu]Cu-DOTA-TATE entre el grupo aterosclerótico y el grupo control (SUVmedia 2,30 ± 0,266 frente a SUVmedia 1,65 ± 0,157, p = 0,047). (D) Las imágenes autorradiográficas muestran la unión de [64Cu]Cu-DOTA-TATE en el arco aórtico y la aorta descendente de una arteria de control y otra aterosclerótica. La unión de [64Cu]Cu-DOTA-TATE fue mayor en la arteria aterosclerótica que en la arteria de control. (E) Sección transversal de la arteria abdominal. Las arterias se incluyeron en parafina y se realizó IHC. La tinción anti-macrófagos de conejo (RAM11) muestra macrófagos que rodean los cristales de colesterol en la placa tanto en la parte abdominal como en el arco aórtico de la arteria aterosclerótica.

En una comparación directa de los tres marcadores, el marcador [64Cu]Cu-DOTA-TATE tuvo la absorción absoluta más alta en el grupo aterosclerótico (Fig. 5A, B) y la diferencia más grande entre el grupo aterosclerótico y el control. (relación-SUVmedia = 1,38) en comparación con [18F]FDG (relación-SUVmedia = 1,22) y Na[18F]F (relación-SUVmedia = 1,30). El análisis por pares de los tres marcadores para el grupo aterosclerótico reveló una captación significativamente mayor de [64Cu]Cu-DOTA-TATE en comparación con [18F]FDG (SUVmedia: 2,29 frente a 1,50, p = 0,0012 y SUVmáx: 9,86 frente a 6,59, p < 0,0001 ) y en comparación con Na[18F]F (SUVmedia: 2,29 frente a 1,55, p = 0,0027 y SUVmáx: 9,86 frente a 5,79, p < 0,0001). Para el grupo de control, la absorción de Na[18F]F fue significativamente menor que la de [18F]FDG y [64Cu]Cu-DOTA-TATE cuando se evaluó como SUVmáx (4,27 frente a 6,75 (p = 0,0019) y 8,32 respectivamente (p < 0,0001)) mientras que no se encontraron diferencias significativas para ninguno de los tres marcadores en el grupo de control cuando se evaluó como SUV medio.

Comparación directa de los tres trazadores PET junto con las imágenes PET/CT correspondientes. Comparación agrupada de los tres trazadores con captación significativamente mayor de [64Cu]Cu-DOTA-TATE en comparación con Na[18F] y [64Cu]Cu-DOTA-TATE en comparación con [18F]FDG para (A) SUVmedio y (B) SUVmáx . Gráficos de correlación entre (C) [18F]FDG y Na[18F]F, (D) [18F]FDG y [64Cu]Cu-DOTA-TATE y (E) entre Na[18F]F y [64Cu]Cu-DOTA -TATE. F) [18F]FDG PET/TC de arteria aterosclerótica (flecha roja). G) PET/TC Na[18F]F en la misma lesión (flecha roja) y H) captación de [64Cu]Cu-DOTA-TATE en la misma zona (flecha roja).

Por análisis de correlación de Pearson ninguno de los trazadores se correlacionó significativamente, con r = 0,381, (p = 0,278) para el grupo aterosclerótico entre [18F]FDG y Na[18F]F (Fig. 5C), r = -0,227 (p = 0,529 ) para el grupo aterosclerótico entre [18F]FDG y [64Cu]Cu-DOTA-TATE (Fig. 5D) y r = 0,503 (p = 0,138) para el grupo aterosclerótico entre Na[18F]F y [64Cu]Cu-DOTA- TATE (Fig. 5E). Las diferencias en la acumulación del trazador se muestran en la figura 5F-H para la aorta abdominal de un conejo aterosclerótico.

El análisis de conglomerados separó los conejos ateroscleróticos de los conejos de control e identificó dos grupos con genes expresados diferencialmente (Fig. 6). De los 102 GOI analizados, 34 GOI estaban significativamente regulados al alza en el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo de control, y 18 GOI estaban significativamente regulados a la baja en el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo de control. En general, los genes asociados con los receptores de la superficie celular, la remodelación de la matriz extracelular y las citocinas y quimiocinas inflamatorias estaban regulados al alza, mientras que los genes regulados a la baja estaban asociados con la adhesión celular y los efectos aterogénicos de la pared vascular (GeneGlobe, QIAGEN). Los genes expresados más diferencialmente se consideraron en el análisis de correlación con los tres trazadores PET, independientemente de los dos grupos (Tabla 1).

Expresión génica del grupo control y del grupo aterosclerótico. Clustergram que muestra la expresión génica en el grupo de control y el grupo aterosclerótico. Cada grupo muestra un grupo específico de genes altamente expresados en comparación con el otro grupo.

Algunos de los genes analizados se correlacionaron con la captación de [18F]FDG. Sin embargo, la mayoría de las correlaciones se encontraron con Na[18F]F y [64Cu]Cu-DOTA-TATE (Tabla 1).

La catepsina K (CTSK) mostró una regulación al alza de 5,40 veces (p < 0,00001) en el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo de control junto con correlaciones positivas tanto con Na[18F]F (r = 0,49, p = 0,0409) como con [64Cu]Cu -DOTA-TATE (r = 0,50, p = 0,0332) (ver Tabla 1). Se observó la misma tendencia con el marcador de macrófagos, CD86, que muestra una regulación al alza de 78 veces en el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo de control (p < 0,00001) (ver Tabla 2). Se encontró una regulación al alza de 235 veces de la integrina alfa L (ITGAL) en el grupo aterosclerótico en comparación con el grupo de control, así como una correlación positiva con Na[18F]F (r = 0,54, p = 0,0113) y [64Cu]Cu- DOTA-TATE (r = 0,47, p = 0,0321).

En este estudio, demostramos la utilidad de [64Cu]Cu-DOTA-TATE para evaluar la aterosclerosis en un modelo de conejo. Mostramos mediante PET/CT y autorradiografía que [64Cu]Cu-DOTA-TATE, [18F]FDG y Na[18F]F se acumulan en las placas ateroscleróticas. Nuestros resultados de imágenes respaldan nuestros hallazgos de alteraciones morfológicas pronunciadas en la pared del vaso arterial y la regulación positiva de marcadores moleculares proaterogénicos en las arterias ateroscleróticas.

[18F]FDG ha sido el trazador común utilizado para la obtención de imágenes PET de la aterosclerosis debido a su capacidad para visualizar la actividad metabólica en las células14. La captación de [18F]FDG está asociada con la diferenciación de macrófagos, la activación celular y el metabolismo celular de la glucosa5,20,21. Sin embargo, la alta captación de [18F]FDG en el miocardio sano y, por lo tanto, el desbordamiento limita su uso en las arterias coronarias.

[64Cu]Cu-DOTA-TATE se dirige específicamente a las células que expresan SSTR2. Dado que SSTR2 se ha encontrado en la superficie de los macrófagos activados y en niveles altos en las placas ateroscleróticas, proporciona una alternativa atractiva a la [18F]FDG con su baja captación en el miocardio sano y una mayor captación de [64Cu]Cu-DOTA-TATE en los macrófagos en comparación con [18F]FDG 12. En el estudio actual también encontramos una captación significativamente mayor de [64Cu]Cu-DOTA-TATE en comparación con [18F]FDG y Na[18F]F. Si bien tanto la [18F]FDG como la [64Cu]Cu-DOTA-TATE se dirigen a la inflamación, no pudimos encontrar una correlación entre la captación del marcador para ninguno de los 3 marcadores investigados, lo que apunta a una información distinta lograda por cada marcador.

Algunos estudios clínicos informaron el uso exitoso de [68Ga]Ga-DOTA-TATE para evaluar la carga aterosclerótica en pacientes14,22,23. En el presente estudio, utilizamos [64Cu]Cu-DOTA-TATE, que se une al mismo objetivo pero debido a un rango de positrones cuatro veces menor de [64Cu] en comparación con [68Ga] (≈1 mm frente a 4 mm), [64Cu] proporciona una resolución espacial mucho mejor de particular valor cuando se evalúan estructuras pequeñas como la pared del vaso. Anteriormente demostramos el efecto beneficioso de [64Cu] en comparación con [68Ga] en imágenes vasculares con mayor captación y mejor correlación con los factores de riesgo cardiovascular24. En el estudio actual encontramos una mayor absorción de [64Cu]Cu-DOTA-TATE en comparación con un estudio reciente en el mismo modelo donde se utilizó [68Ga]Ga-DOTA-TATE12.

Después de la inflamación de la placa, la diferenciación osteogénica da lugar al desarrollo de microcalcificación impulsado por la actividad metabólica mineral. Las microcalcificaciones son marcadores de etapas más inestables de la aterosclerosis, lo que podría conducir potencialmente a la ruptura de la placa causada por la desestabilización de la cubierta fibrosa que rodea la placa25. Las macrocalcificaciones pueden detectarse por TC en etapas tardías a diferencia de las microcalcificaciones que no son detectables por TC26. La captación de Na[18F]F en microcalcificaciones tempranas se correlaciona con la respuesta de cicatrización de las placas ateroscleróticas. Así, el Na[18F]F se asocia con inflamación y placa de alto riesgo27. En este estudio, las arterias ateroscleróticas mostraron una captación significativamente mayor de Na[18F]F en comparación con los controles de la misma edad, lo que posiblemente indica una mineralización metabólicamente activa. La Figura 3B muestra lesiones particulares con alta captación de Na[18F]F, que confirman la presencia de microcalcificaciones y aterosclerosis, mientras que no se evidenciaron calcificaciones en las tomografías computarizadas de los conejos ateroscleróticos. Validamos los hallazgos de la PET/TC con histología e IHC. Las tinciones confirmaron la infiltración de macrófagos que rodeaban las células espumosas y cristales de colesterol, y la presencia de microcalcificaciones. Los hallazgos autorradiográficos de la aorta torácica también se confirmaron mediante histología e IHQ, y no se encontraron diferencias pronunciadas en la carga aterosclerótica entre la parte abdominal y la torácica de la aorta.

La comparación de la expresión génica de las arterias ateroscleróticas con las arterias de control reveló genes regulados al alza asociados con la aterosclerosis a través de varias vías. Los genes más regulados al alza se eligieron para un análisis de correlación con los tres marcadores utilizados en este estudio. Solo unos pocos genes se correlacionaron con [18F]FDG, mientras que varios genes se correlacionaron con la acumulación de [64Cu]-Cu-DOTA-TATE y Na[18F]F. Anteriormente, se había encontrado que CTSK estaba asociado con la captación de FDG en la placa carotídea en humanos y no asociado con la captación de [64Cu]-Cu-DOTA-TATE28. Por el contrario, nuestros hallazgos muestran una correlación positiva entre CTSK y [64Cu]-Cu-DOTA-TATE y Na[18F]F, pero no hay correlación con [18F]FDG. Confirmamos que [64Cu]-Cu-DOTA-TATE se correlaciona con la infiltración de macrófagos con una correlación positiva con CD86 pero no encontramos una correlación con el marcador de macrófagos activados CD163 como encontró previamente nuestro grupo15. Se encontró una correlación positiva entre los marcadores de macrófagos CD36, CD86 y CD163 y Na[18F]F, lo que indica que la actividad de Na[18F]F se correlaciona no solo con la microcalcificación, sino también con la infiltración de macrófagos29.

El TNF es una citocina relacionada con macrófagos M1 activada y está implicada en la inflamación sistémica. En nuestro estudio, encontramos que el TNF se correlaciona positivamente tanto con [18F]FDG como con Na[18F]F. Estos resultados están en línea con un estudio previo que encontró una correlación positiva en las placas ateroscleróticas inflamadas entre TNF y [18F]FDG30.

IL-10 es una citoquina antiinflamatoria con propiedades desactivantes en la modulación de macrófagos y protege contra la aterosclerosis. Se incrementó en el grupo aterosclerótico en 14 veces y se correlacionó positivamente con [64Cu]-Cu-DOTA-TATE. También se encontró que un predictor de la progresión de la aterosclerosis, ITGAL, se correlaciona con [64Cu]-Cu-DOTA-TATE y Na[18F]F. De todos los genes investigados, ITGAL se expresó de manera más diferencial entre el grupo aterosclerótico y el grupo de control. La expresión de ITGAL es una firma para los monocitos inflamatorios, que junto con otras células inmunitarias se acumulan y se convierten en placa aterosclerótica31,32.

La expresión génica se realiza ex vivo y exige un enfoque invasivo. La imagenología molecular por PET/CT proporciona un enfoque no invasivo. Además, las exploraciones PET/CT se pueden realizar en varios puntos de tiempo para seguir la progresión de la enfermedad.

Una limitación del modelo de conejo es la falta de progresión de la enfermedad en placas inestables y eventos cardiovasculares. La hemorragia intraplaca, la ruptura de la placa y los infartos rara vez se ven en este modelo. Otra limitación es el uso de solo conejos machos en el estudio; sin embargo, esto se eligió para evitar el efecto potencial de los cambios hormonales en las conejas. Se necesitan futuros ensayos clínicos prospectivos para confirmar que tanto [64Cu]Cu-DOTA-TATE como Na[18F]F predicen la vulnerabilidad de la placa.

Demostramos el valor de [64Cu]Cu-DOTA-TATE y Na[18F]F para la evaluación de la aterosclerosis. Los resultados obtenidos son distintos a los obtenidos con [18F]FDG y no se encontraron correlaciones significativas entre los tres trazadores. La absorción de [64Cu]Cu-DOTA-TATE fue significativamente mayor en conejos ateroscleróticos en comparación con [18F]FDG y Na[18F]F. Los biomarcadores inflamatorios clave, como CD36, CD86 e ITGAL, aumentaron en los conejos ateroscleróticos y se correlacionaron con la acumulación de trazadores de [64Cu]Cu-DOTA-TATE y Na[18F]F, pero no se correlacionaron con [18F]FDG.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE220754.

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Este proyecto recibió financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud de los acuerdos de subvención no. 670261 (ERC Advanced Grant) y 668532 (Click-It), Lundbeck Foundation, Novo Nordisk Foundation, Innovation Fund Denmark, Danish Cancer Society, Arvid Nilsson Foundation, Neye Foundation, Research Foundation of Rigshospitalet, Danish National Fundación de Investigación (subvención 126): PERSIMUNE, el Consejo de Investigación de la Región Capital de Dinamarca, la Autoridad de Salud Danesa, la Fundación John and Birthe Meyer y el Consejo de Investigación para la Investigación Independiente. Andreas Kjaer es profesor de la Fundación Lundbeck.

Departamento de Fisiología Clínica, Medicina Nuclear y PET y Grupo de Imágenes Moleculares, Hospital Universitario de Copenhague–Rigshospitalet y Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Copenhague, Blegdamsvej 9, 2100, Copenhague, Dinamarca

Constance E. Grandjean, Sune F. Pedersen, Camilla Christensen, Altea Dibenedetto, Tina Binderup y Andreas Kjaer

Departamento de Ciencias Veterinarias Clínicas y Animales, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Tomas Eriksen

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CEG: investigación, metodología, recopilación de datos, análisis formal, redacción: borrador original, redacción: revisión y edición, SFP: investigación, conceptualización, recopilación de datos, redacción: revisión y edición CC: investigación, AD: análisis formal, redacción: revisión y edición, TE: investigación, redacción: revisión y edición, TB: supervisión, metodología, recopilación de datos, análisis formal, validación, redacción: borrador original, redacción: revisión y edición, AK: supervisión, conceptualización, redacción: revisión y edición, proyecto administración, Adquisición de Financiamiento. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Andreas Kjaer.

Andreas Kjaer es inventor/posee derechos de propiedad intelectual sobre 64Cu-DOTA-TATE para uso humano. Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Grandjean, CE, Pedersen, SF, Christensen, C. et al. Obtención de imágenes de la aterosclerosis con [64Cu]Cu-DOTA-TATE en un estudio de comparación directa traslacional con [18F]FDG y Na[18F]F en conejos. Informe científico 13, 9249 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35302-5

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Recibido: 02 Diciembre 2022

Aceptado: 16 mayo 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35302-5

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